Как брать мазок на хламидии у кошек из влагалища

Срок исполнения

Хламидии — облигатные внутриклеточные бактерии рода Chlamydiales, которые вызывают главным образом конъюнктивит у кошек, но также могут играть роль в развитии системных и репродуктивных патологий у собак и кошек, которые до настоящего времени недостаточно хорошо изучены. Хламидии существуют в двух формах: элементарное инфекционное тельце, имеющее диаметр от 0,2 до 0,6 мкм, которое существует вне клетки, и ретикулярное тельце, имеющее больший размер (от 0,5 до 1,5 мкм), которое не является инфекционным и способно делиться в цитоплазме клеток хозяина до достижения зрелости — образования элементарного инфекционного тельца. Элементарные тельца способны выживать во внешней среде при комнатной температуре в течение всего нескольких дней и быстро инактивируются большинством дезинфектантов. Передача инфекции главным образом в основном происходит при прямом контакте, иногда путем, возможно инфицирование котят матерью после рождения. Контаминированные предметы играют важную роль в передаче инфекции при групповом содержании кошек.
Хламидии локализуются в эпителиальных клетках зрительной, дыхательной, пищеварительной и мочеполовой систем; сообщалось об инфекциях с поражением синовии. У одних видов хламидий имеется тенденция к видоспецифичности, другие виды могут вызывать инфекции у различных видов животных.
Наиболее значимым патогеном у кошек по всему миру является Chlamydophila felis, вызывающая острый и хронический конъюнктивит. Инфекция чаще всего наблюдается в условиях группового содержания кошек, особенно в питомниках. ДНК C. felis редко обнаруживается в мазках с конъюнктивы от клинически здоровых кошек. Имеются данные, согласно которым хламидии обнаруживаются у 30% кошек с конъюнктивитом. Инфекция C. felis чаще встречается у молодых кошек, главным образом, в возрасте от 2 до 12 месяцев. Защита от инфекции котят до двух месяцев обеспечивается материнскими антителами, хотя сообщалось о случаях неонатальных инфекций. У кошек старше 5 лет развитие инфекции C. felis очень маловероятно. Часто наблюдаются коинфекции с другими респираторными патогенами, такими как герпесвирус кошек 1 () и калицивирус кошек (FCV).
Неизвестно, возможна ли передача инфекции половым путем, как в случае с другими видами хламидий, однако у некоторых из инфицированных кошек микроорганизмы обнаруживаются в выделениях из влагалища. Также отмечаются выделения из прямой кишки и глаз.
После попадания элементарных инфекционных телец в организм животного они превращаются в ретикулярные тельца, которые размножаются с помощью простого деления с образованием включений, которые не подвергаются слиянию с лизосомами. Затем ретикулярные тельца вновь превращаются в элементарные тельца, которые высвобождаются во внеклеточное пространство после лизиса клетки и инфицируют другие клетки хозяина. Полный цикл репликации продолжается около двух дней.
Хламидии поражают главным образом эпителиальные клетки, однако могут инфицировать клетки эндотелия, гладкой мышечной ткани, лимфоциты, моноциты и макрофаги. C. felis размножается в цитоплазме эпителиальных клеток конъюнктивы, после чего с кровотоком микроорганизм проникает в миндалины, легкие, печень, селезенку, органы тракта и почки. Через 2–5 дней после инфицирования обычно наблюдается острый, хронический или рецидивирующий конъюнктивит, при этом регистрируются симптомы ринита, такие как выделения из носа и чихание. Клиническое состояние большинства кошек остается удовлетворительным, аппетит сохраняется. Симптомы поражения нижних отделов респираторного тракта, такие как кашель и диспноэ, наблюдаются в редких случаях, так же как кератит и изъязвление роговицы. Последние обычно вызываются коинфекцией таких патогенов, как .
После периода острого конъюнктивита инфекция может персистировать в течение многих месяцев, сопровождаясь слабо выраженным конъюнктивитом, либо симптомы болезни могут отсутствовать.
В одном исследовании хламидии были выделены из конъюнктивы через 215 дней после экспериментального инфицирования. Остается неясным, является ли хроническая форма заболевания результатом реинфицирования либо персистирования хламидий в организме. Коинфекции другими патогенами, такими как FCV, , Bordetella и Mycoplasma могут способствовать повышению тяжести заболевания и продолжительности периода выделения микроорганизма во внешнюю среду.
Остается неясным, может ли инфекция C. felis вызывать поражение репродуктивной системы у кошек. В этом могут играть роль такие факторы, как срок беременности, наличие коинфекции, например, , наличие иммуносупрессии, путь передачи инфекции, штамм микроорганизма.
Инфекции хламидий редко встречаются у собак. Сообщалось об инфекции Chlamydia psittaci у собак с респираторными заболеваниями, сопровождавшимися пневмонией и плевральным выпотом, а также кератоконъюнктивитом. В одном исследовании у группы сук с выделениями из глаз и признаками поражения нижних отделов дыхательных путей были случаи рождения мертвых щенков снижения размера помета. По результатам исследования мазков с конъюнктивы и глотки методом ПЦР была обнаружена C. psittaci.
Внедрение метода ПЦР в диагностике инфекций хламидий у животных было революционным прорывом ввиду его быстроты, чувствительности и специфичности. Дополнительным преимуществом является тот факт, что образцы для исследования не требуют специальных условий при транспортировке.
Существуют ПЦР, как стандартные, так и в реальном времени, в которых в качестве образца для исследования обычно используются мазки с конъюнктивы.
Необходимо иметь в виду, что после начала антибиотикотерапии в течение нескольких дней результаты ПЦР обычно остаются положительными. Использование растворов для местного применения, таких как проксиметакаин и флюоресцеин, не оказывает влияния на результаты исследования методом ПЦР в реальном времени на наличие инфекции C. felis, однако наблюдается незначительный ингибирующий эффект при использовании фузидовой кислоты. Ввиду того, что у некоторых кошек при отсутствии конъюнктивита возможно получение положительных результатов ПЦР на C. felis, интерпретация данных должна осуществляться с учетом данных анамнеза, наблюдаемой клинической картины и реакции на проводимое лечение.

Для диагностики данного возбудителя у кошек доступны следующие локализации:

• AN 339 НОС- в качестве биоматериала берут соскоб эпителиальных клеток слизистой носовой полости и помещают в микропробирку с транспортной средой. Образец стабилен при температуре +2.+8 ℃ до 10 дней;
• AN 339 ГЛЗ — в качестве биоматериала берут соскоб эпителиальных клеток конъюнктивы и помещают в микропробирку с транспортной средой. Образец стабилен при температуре +2.+8 ℃ до 10 дней;
• AN 339 БАЛ — смыв из бронхов, полученный путем БАЛ, хранится при температуре +2.+8 ℃ до 3 дней, в пробирке с ЭДТА.

Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

РЕЗУЛЬТАТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обнаружение или не обнаружение в исследуемой пробе ДНК С. felis.

Результаты исследования содержат информацию исключительно для врачей. Диагноз ставится на основании комплексной оценки различных показателей, дополнительных сведений и зависит от методов диагностики.

Развитие воспаления конъюнктивальной оболочки глаз у домашнего питомца провоцирует бактерия Chlamydophila Felis. Кошка заражается, охотясь на птиц или мышей, при контакте с калом, слюной или мочой больного грызуна или пернатого. Инфицирование другим микробом Chlamydophila psittaci, что приводит к поражению внутренних органов, происходит и через половые пути. Котенок может заразиться хламидиозом при родах или в утробе матери.

Болеют и домашние животные, хозяева которых никогда не выпускают питомцев на улицу. Возбудитель хламидиоза заносится в комнату с обувью, одеждой, сумкой владельца. Питомцы, гуляющие вместе с бродячими кошками, заражаются гораздо чаще. Хламидии имеют такую же клеточную оболочку, как и грамотрицательные бактерии, но элементарные тельца, как и у вирусов, у них состоят из одной молекулы ДНК. Эти микроорганизмы опасны для человека со слабым иммунитетом, ухаживающего за инфицированным животным.

Во внешней среде хламидии живут до полутора суток. Паразиты погибают за минуту, если попадают в кипяток. Уничтожают вредоносные микробы:

• ультрафиолетовые лучи;
• хлорамин;
• фенол.

При проникновении в организм кошки хламидии внедряются в клетки эпителия слизистых желудка, кишечника, мочевого пузыря, полости рта и глотки, в конъюнктивальную оболочку, где разрушают их защиту и начинают размножаться, что происходит в виде бинарного деления.

Внимание! Скрытый период инфицирования внутриклеточными микробами продолжается 1-2 недели.

Симптомы

На начальных этапах хламидиоз можно спутать с простудой или другой патологий, но нередко он протекает вообще бессимптомно, особенно это касается пищеварительного тракта. Признаки болезни отсутствуют, но вместе с калом и слюной у кошки выходят хламидии, которые попадают в окружающую среду.

Питомец не набирает вес, выглядит истощенным, иногда хромает, отказывается от любимого корма. Если хламидиоз приобретает хронический характер у кошки постоянно красные глаза, в уголках образуется корочки красновато-кирпичного цвета.

Острая форма патологии проявляется более выражено, клиническая картина зависит от того, какие органы поражены хламидиями.

Внимание! Игнорирование признаков поражения органов зрения приводит к воспалению роговицы или появлению катаракты, которая нередко заканчивается слепотой.

Уход за кошкой во время болезни

Любимцев, зараженных хламидиозом, изолируют от других питомцев и не выпускают на улицу.

Изменение в кормлении

Чтобы не допустить развития дисбактериоза в рацион кошки добавляют йогурты и другие кисломолочные продукты, в которых присутствуют лактобактерии. Питомцу нужно давать куриный бульон и жидкие лечебные корма, так как в них легче добавить лекарства в твердой форме, предварительно измельченными в порошок.

Личная гигиена

Помещение, где находится зараженное хламидиозом животное, необходимо обработать дезинфицирующими средствами. Нужно более тщательно следить за гигиеной больной кошки, чаще убирать лоток. Хозяину надо чистить обувь при входе в квартиру, обязательно мыть руки с мылом после контакта с питомцем.

Желательно не сильно тревожить больное животное (меньше играть с ним и не подпускать к любимцу семьи маленьких детей).

Опасность для человека

Если игнорировать гигиену при уходе за больным питомцем, домочадцы могут заразиться инфекцией, вызываемой хламидиями. Патология проявляется в виде воспаления конъюнктивы, но случается такое лишь при ослабленном иммунитете. Хламидиоз может привести к бесплодию у женщин. Поэтому необходимо не допускать никаких контактов с больными котятами беременных женщин, малышей и пожилых людей.

Опасность представляет хламидиоз, имеющий хронический характер, поскольку часто никто из членов семьи даже не подозревает, что кошка больна. Так у возбудителя есть больше времени, чтобы передаться члену семьи или другой кошке.

Важно! Возбудители хламидиоза у кошек и собак различны, поэтому кошка не может заразить хламидиями собаку.

Острый хламидиоз выражен ярче всего, но со временем признаки болезни становятся менее заметными, патология приобретает хронический характер. Сначала происходит повышение температуры тела животного, затем начинаются выделения из глаз и носа. Обычно поначалу поражается один глаз, а через 2-3 недели второй. При присоединении бактериальной инфекции образовываются корочки, которые наполняются гноем.

ВАЖНО. Для исключения ложных результатов перед сбором материала для ПЦР минимум 12 часов не нужно ничем обрабатывать слизистые. Также после вакцинации должно пройти 2-3 недели.

Понадобится:
1. пробирки типа Эппендорф 1,5 мл
2. обычные ватные палочки
3. физраствор (NaCl)

При наличии этих трех составляющих любой неравнодушный хозяин сможет взять материал для исследования через смывы или мазки.

Ниже примерная таблица заболеваний, на которые мы сможем взять анализы. Здесь есть некоторые тонкости, о которых я постараюсь чуть ниже упомянуть. Будет полезно хоть раз посмотреть, как это делают врачи в ветклиниках. Список может быть чуть больше, я беру лишь самые распространенные заболевания.

Заболевание — Способ взятия материала:

Панлейкопения (ПЦР) — Кал/ректальный мазок.
Калицивироз (ПЦР) — Соскобы с язв ротовой полости, смывы из носоглотки и ротоглотки, конъюнктивы глаз (кошки).
Микоплазмоз (ПЦР) — Смывы со слизистых, мокрота, выделения из носа и глаз.
Ринотрахеит (герпесвирус кошек 1 типа) (ПЦР) — Смывы со слизистых носоглотки, глаз, с изъязвлений ротовой полости, мокрота.
Токсоплазмоз (ПЦР) — Кошки — мазки из прямой кишки, фекалии; смывы с конъюнктивы.
Хламидиоз (ПЦР) — Смывы со слизистых (конъюнктивы, урогенитального тракта).

Смывы со слизистых и выделения берем с помощью ватных палочек, помещаем в пробирки Эппендорфа с 0,5 мл физраствора (обрезая пластиковую палочку).

Про сбор: головку ватной палочки смочить в физрастворе, а затем собрать анализ. Если не смочили, это не критично.

В идеале пробирки должны быть стерильными, но на практике это часто не так. Ни в Беланте, ни в Весте я ни разу не видела стерильных пробирок. В любом случае нам ничто не мешать обдать кипятком сами пробирки. Пластик в пробирках прочный, позволяет выдерживать высокую температуру.

ВАЖНО. Чтобы несколько раз ватными палками не раздражать слизистые животного — на микоплазмоз, кальцивироз, ринотрахеит, хламидиоз можно взять анализ одной палочкой в одну пробирку (в лаборатории они всё равно смешиваются).
На панлейкопению — отдельно 1 ватную палочку на 1 пробирку.

Чтобы лучше взять смывы с конъюнктивы, нужно немного оттянуть нижнее веко и плавно провести головкой ватной палочки. Если что-то скапливается в уголках глаз, желательно это добро подхватить на головку палочки. Стараемся проводить от чистых участков к грязным — НЕ наоборот.
Если у животного один глаз выглядит здоровым, а другой больным, то на 2 глаза используем 2 отдельных палочки или одной палочкой идем от чистого к грязному.

Чтобы взять ректальный мазок, ватная палочка на 1-2 см (зависит от размера животного) должна войти в анальный проход. Процедура эта не очень приятная, но если всё сделать быстро и правильно, то всё не так страшно.

Материал для анализов доставляем в лабораторию в день взятия или на следующий день. Допускают хранение в холодильнике (4°С) в течение 1-2 дней. Транспортировать анализы можно, обложив пробирки любыми замороженными овощами. Они не так текут, как чистый лед.

ВАЖНО. Чтобы несколько раз ватными палками не раздражать слизистые животного — на микоплазмоз, кальцивироз, ринотрахеит, хламидиоз можно взять анализ одной палочкой в одну пробирку (в лаборатории они всё равно смешиваются).
На панлейкопению — отдельно 1 ватную палочку на 1 пробирку.

*Доп. оплачиваются расход. материалы: нет

Доп. оплачивается амбулат. прием: нет

Бактериологический анализ представляет собой лабораторное исследование, заключающееся в посеве взятого от больного материала (кожа, кровь, сперма, слизистые ротовой полости, дыхательных и мочеполовых путей, желудочно-кишечного тракта, органов зрения, слуха и обоняния и др.) на питательные среды, на которых вырастают колонии бактерий, изучаемых и идентифицируемых потом под микроскопом.

С помощью бак анализа обнаруживается не только патогенная, но и условно патогенная флора. Одновременно с посевом материала производится посев микрофлоры на чувствительность к антибиотикам и составляется антибиотикограмма, которая позволяет доктору назначить необходимое лечение с учетом чувствительности животного к антибиотику. Дело в том, что при некорректном использовании антибиотиков микроорганизмы способны вырабатывать устойчивость к ним. Бывают случаи, когда не представляется возможным подобрать препарат и остаётся надеяться на чудо и иммунную систему животного.

Суть бак анализа заключается в помещении биологического материала в среду, благоприятную для развития бактерий, на определенное время и при установленной температуре. Каждому возбудителю нужна своя «родная» среда с учетом ее рН, окислительно-восстановительных потенциалов, вязкости, влажности и осмотических свойств. Среды могут быть мягкими и твердыми, простыми и сложными, универсальными и не очень, однако во всех случаях они должны обеспечивать питание, дыхание, размножение и рост бактериальной клетки.

Сам анализ является довольно трудоемким и многоэтапным процессом, требующим от специалиста особого внимания.

Цель бактериологического исследования.

• Коррекция назначенного лечения.

• Собственная безопасность.

С помощью бактериологического исследования можно выявить возбудителей, опасных или потенциально опасных не только для животных, но и для человека, так называемых зоонозов.

• высокая чувствительность возбудителя к препарату,

• широкий спектр действия препарата,

• поликомпонетный препарат,

• различный механизм действия.

С помощью бак анализа обнаруживается не только патогенная, но и условно патогенная флора. Одновременно с посевом материала производится посев микрофлоры на чувствительность к антибиотикам и составляется антибиотикограмма, которая позволяет доктору назначить необходимое лечение с учетом чувствительности животного к антибиотику. Дело в том, что при некорректном использовании антибиотиков микроорганизмы способны вырабатывать устойчивость к ним. Бывают случаи, когда не представляется возможным подобрать препарат и остаётся надеяться на чудо и иммунную систему животного.

Гончаров С.Б.
Ветеринарный врач

В последнее десятилетие интерес медицинских и ветеринарных специалистов многих стран мира привлекают хламидии, которые широко распространены среди различных видов животных, что обусловлено наличием неконтролируемого резервуара возбудителя инфекции в природе.[6] Хламидии способны вызвать заболевание более чем у 200 видов млекопитающих, а также у птиц и рептилий. Зараженные животные могут стать источником инфекции человека.[10, 24] Таким образом, хламидиоз является зооантропонозом, т.е. инфекционной болезнью общей для человека и животных.

Патология, вызываемая хламидиями, довольно разнообразна. У птиц встречаются респираторная, энтеральная и генерализованная формы.[15] У млекопитающих заболевания проявляются в виде энзоотических абортов, плацентитов, вагинитов и полиартритов.[3, 31] У человека эти микроорганизмы вызывают более 20 клинических синдромов, в частности, фарингиты, отиты, бронхопневмонии, миокардиты, артриты, поражение нервной системы и глаз, а также венерические гранулемы и урогенитальные поражения.[5, 6, 7, 8] Исследования, проведенные во многих странах в течение последних десяти лет, показали, что среди домашних животных – хламидиоз, в клинически выраженной форме, чаще всего встречается у кошек.[16, 17]

Возбудители болезни – Chlamydophila psittaci и Chlamydophila felis. Они относятся к одной из малоизученных групп микроорганизмов. Особенностью хламидий является способность при неблагоприятных условиях (некорректная терапия, и пр.) трансформироваться в латентные (L) формы, что сопровождается длительной персистенцией возбудителя и хроническим течением болезни. Это создаёт серьёзные трудности в диагностике и лечении заболевания, так как L-формы хламидий не чувствительны к антибиотикам и трудно диагностируются.[22] В латентной форме эти возбудители очень устойчивы к химическим и физическим воздействиям, в активной форме на них губительно действуют УФЛ, кипячение, 700C этиловый спирт и другие дезинфицирующие средства.[14, 20, 43]

Часто опасность заражения человека хламидиозом исходит от птиц, в особенности от попугаев и голубей.

Штаммы хламидий, выделенные от птиц, считаются для человека особенно патогенными. Заражение происходит аэрогенным путем за счет вдыхания пыли, содержащей во взвешенном состоянии выделения и частицы перьев птиц, инфицированных хламидиями.[15, 27, 40]

В 1980-м году были описаны 20 случаев заражения человека хламидиями от млекопитающих. Кошки заражаются почти всеми штаммами возбудителя. Птицы и мыши, на которых они охотятся, являются природным резервуаром и первичным источником инфекции. Заражение человека происходит при тесном контакте с кошкой, у которой инфекция может протекать латентно.[33]

Этиологическая роль кошачьих хламидий пока до конца не выяснена, хотя в литературе имеются примеры зооантропонозной природы этой инфекций. Так, в США двадцатилетний мужчина заболел односторонним фолликулярным конъюнктивитом после того, как у его кошки проявились симптомы поражения конъюнктивы. Как у кошки, так и у её хозяина в конъюнктивальных мазках, взятых в этих случаях, были найдены тельца-включения, типичные для хламидий. Полагают, что антиген от кошки к человеку попал через нанесенные кошачьи царапины.[2]

В соответствии с решением юридической комиссии Международной ассоциации микробиологических обществ (МАМО), с 1980г. эти микроорганизмы получили родовое название Chlamydia. До 1989г. были известны только 2 вида хламидий — C.trachomatis и C.psittaci. С 1989г. выделяют третий самостоятельный вид хламидий — C.pneumoniae, а в 1993г. японскими микробиологами описан и четвертый вид — C.pecorum (Fukushi Н., Hirai К., 1993). По новой классификации речь идет о патогенных для человека микроорганизмах Chlamydia trachomatis, серовары D-K, принадлежащих в роду Chlamidia. К этому же роду относится также вид C.muridarum, патогенный для мышей и хомячков, и вид C.suis, инфицирующий свиней.[24, 33]

Хламидии являются грамотрицательными бактериями. Они имеют сходную с бактериями клеточную стенку, их генетический аппарат представлен нуклеиновыми кислотами – ДНК и РНК, чувствительны к антибиотикам, что сближает их с грамотрицательными бактериями.[32] Однако они не способны размножаться на искусственных питательных средах, и для репродукции им нужна живая чувствительная клетка как внутриклеточным микроорганизмам, что роднит их с вирусами.[41]

Хламидии обладают способностью блокировать механизмы иммунной защиты хозяина путем предотвращение слияния фагосомы с лизосомами.

Благодаря этому клетки хозяина не только предохраняют инфект, но и способствуют их росту. Для размножения и роста внутриклеточные патогены используют питательные вещества и продукты жизнедеятельности клетки-хозяина. В процессе своего размножения хламидии разрушают цитоплазматические включения, выходят из клетки-хозяина во внешнюю среду и заражают новые клетки.[12]

Патогенез хламидийной инфекций может быть представлен в виде следую­щей схемы: хламидии являются внутриклеточными облигатными паразитами, обладают высоким политропизмом. Проникнув в организм аэрогенным, али­ментарным или половым путем, возбудитель первично размножа­ется в эпите­лиальных клетках слизистых оболочек и макрофагах. Затем внед­ряется в кровь и заносится практически во все внутренние органы, лимфатические узлы, сус­тавы и даже в головной и спиной мозг.[30]

Естественный цикл развития хламидий проходит в цитоплазматических включениях живых клеток (элементарное тельце ® ретикулярное тельце ® ретикулярные тельца ® промежуточные тельца ® элементарные тельца) и продолжается от двух до трех суток. Элементарные тельца ответственны за процесс прикрепления к клетке-мишени и проникновения в нее. Они устойчивы к факторам окружающей среды. Мелкие и оптически плотные элементарные тельца имеют ригидную клеточную стенку, жесткость структуры которой обеспечивается плотными дисульфидными связями основного белка наружной мембраны и двумя богатыми цистеином белками: белком оболочки и липопротеином наружной мембраны. Ретикулярные тельца – это большие, метаболически активные формы, синтезирующие ДНК, РНК и белки. Ретикулярные тельца являются высоко лабильными формами, которые не способны выжить вне клетки-хозяина.[42]

Хламидии проявляют выраженную чувствительность к действию коротковолновых и длинноволновых ультрафиолетовых лучей и высокой температуры. Элементарные тельца теряют свою инфекционность в 24-36 часов при 370С. Концентрированная суспензия хламидий инактивируется в течение 1 мин.

при 95-1000С, через 10-15 мин. при 700С, через 30 мин. при 500С.

Установлена возможность сохранения инфекционности материала на хлопчатобумажных тканях до 2 суток при 18-190С.

Хламидии на стадии ретикулярных телец высокочувствительны к действию 70% этанола, 2% раствор лизола, 0,05% раствора нитрата серебра, 0,1% раствора йодида калия, 0,1% раствора перманганата калия, перекиси водорода, этилового эфира и инактивируются при комнатной температуре в течение 2 суток.[35]

Активная форма хламидиоза кошек – высококонтагиозная полисимтоматическая болезнь, проявляющаяся, чаще всего, об­щей слабостью, скованностью движений, повы­шен­ной температурой тела, конъюнктивитом, ринитом, отдышкой, гастритом, эндометритом, вагинитом. Реже встречаются поражения других органов и систем. При урогенитальной локализации хламидии вызывают аборты, мертворождения и бесплодие. Хламидиоз наи­более часто поражает котят в возрасте от 5-ти недель до 9-ти месяцев. Взрослые животные также могут заражаться, поскольку естест­венный иммунитет не продолжителен, имеет не высокую напряженность. Велика вероятность повторного заражения, так как гуморальные антитела, циркулирую­щие в крови, не могут защитить организм от реинфекции.[16]

Инкубационный период длится от 5 до 10 дней. В начале забо­левания обычно отмечают легкую лихорадку, длящуюся несколько дней. Заболевшие кошки обычно продолжают принимать корм и, как правило, чувствуют себя хорошо, проявляя лишь конъюнктивальный дискомфорт. Конъюнктивит начинается в большинстве случаев унилатерально (односторонне), выделение из глаза – сероз­ные. Через 10 – 17 дней поражается второй глаз. Конъюнктивит может продол­жаться от нескольких дней до нескольких месяцев, а иногда принимает хрони­ческое течение. По мере развития болезни конъюнктива становится более гипе­ремированной, а выделения – слизисто-гной­ными вследствие вторичной бакте­риальной инфекции.[38]

Поражение дыхательных путей часто проходит бессимптомно или со слабо выраженными признаками. Поэтому диагностировать хламидиозную пневмонию можно только гистологическими методами. Очаги поражения легочной ткани в виде мелких ограниченных гиперемированных участков со слабой аэрацией, располагаются преимущественно в периферических участках легкого рядом с бронхиолами.

Нарушение репродуктивной функции у кошек, включая аборты, отмечались довольно часто в кошачьих питомниках, где наблюдается эндемическое тече­ние болезни.

Внедрение хламидий в мочеполовой тракт редко сопровождается заметными клиническими проявлениями. Заболевание чаще бывает асимптомным или скрытым.

Диагностика хламидиоза кошек затруднена, поскольку многие клинические признаки присущи другим заболеваниям – калицивирусной и реовирусной инфекциям.[17]

Ни один из современных методов диагностики внутриклеточных патогенов не обеспечивает выявление возбудителя в 100% случаев. Поэтому лабораторная диагностика хламидий должна включать в себя сочетание не менее двух методов (прямых или непрямых).[23]

1. Методы прямого выявления бактерий:

· Микробиологическое исследование – выделение чистой культуры возбудителя;
· Цитологическое исследование мазков, окрашенных по методу Романовского-Гимза;
· Иммунологическое исследование – выявление антигенов возбудителя в мазках с помощью специфических антител (реакция прямой иммунофлуоресценции – РИФ), ДНК-зонды;
· Молекулярно-биологические методы – определение специфического участка ДНК/РНК в геноме возбудителя (полимеразная цепная реакция – ПЦР, лигазная цепная реакция – ЛЦР);
· Серологическое исследование – определение бактериальных антигенов (иммуноферментный анализ – ИФА);
· Методы экспресс-диагностики хламидий (иммунохроматография и ферментспецифическая реакция).

2. Непрямой метод, косвенно указывающий на наличие возбудителя у пациента:

· Серологическое исследование – определение специфических антител, образовавшихся в процессе иммунного ответа на микроорганизм (реакция связывание комплемента – РСК, реакция непрямой иммунофлуоресценции – РНИФ, иммуноферментный анализ – ИФА, реакция микроиммунофлуоресцинции – МИФ, рекомбинантный липополисахаридный ИФА – r-ELISA).[1, 18]

Методы прямого выявления хламидий.

Наиболее чувствительным, но трудоемким методом лабораторной диагностики является микробиологическое исследование.

Для размножения in vitro хламидий необходимы клеточные линии млекопитающих. Для этой цели используют культуру клеток McCoy представляющую собой гибридные клеточные линии из человеческих синовиальных клеток и мышиных фибробластов, а также клетки Hela – перманентную клеточную линию из человеческой карциномы и L-299 – культуру клеток мышиных фибробластов.

Для C. psittaci наиболее эффективно применяют перманентную клеточную линию из почек африканской зеленой мартышки (BGM), в то время как для C. trachomatis клетки McCoy.

Критерием диагностического выделения хламидий служит выявление в инфицированных клетках типичных цитоплазматических включений в окрашенных препаратах при первичном заражении или в серии из 1-2 пассажей при отсутствии бактериальной контаминации.

При микробиологическом методе исследования возможно получение ложно-негативных результатов. Это происходит вследствие гибели возбудителя при нарушении правил забора биологического материала или во время его транспортировки в микробиологическую лабораторию.

Цитологический метод – метод непосредственной микроскопии — патологического материала (сос­коб с пораженной слизистой оболочки) был основным способом обнаруже­ния хламидий. При этом использовали окраску препаратов по Стемпу, Мак­киавелло и Романовскому-Гимзе. Окраска по Стемпу придает элементарным тельцам хламидии красно-фиолетовый цвет на синем фоне препарата; по Маккиавелло хламидии окрашиваются в ярко-красный цвет, клетки патоло­гического материала – в светло-синий, ядра клеток – в темно-синий цвет; по Романовскому-Гимзе элементарные включения хламидии приобретают красно- фиолетовый цвет, а ретикулярные тельца пораженной клетки – си­ний, ядро клеток – бордово-фиолетовый и их цитоплазма – голубой. Окра­шенные мазки исследуют с иммерсионной системой. Клеточные включения при микроскопии находят в виде скопления в цитоплазме вокруг ядра пора­женной клетки и образующих компактные включения в форме “ шапочки жандарма”.

Включения могут располагаться в цитоплазме клетки диффузно. Цитологический метод в последнее время практически не используется, в связи с низкой чувствительностью – диагностировать хламидийную инфекцию у больных животных удается лишь в 10-12% случаев.[18]

Одним из самых распространенных методов диагностики является метод иммунофлуоресценции, позволяющие выявить цитоплазматические включения хламидий с содержащимися в них антигенами.

Прямой метод иммунофлуоресценции основан на выявлении хламидийных антигенов в клинических образцах от животных с помощью лиофилизированных моноклональных антихламидийных иммуноглобулинов, меченных флуоресцин-изотиоционатом (ФИТЦ), с синькой Эванса и азидом натрия.

Высокая специфичность моноклональных антител позволяет диагностировать наличие элементарных телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой ярко-зеленые образования с ровными краями округлой формы. Размеры их составляют 1/100 от окружающих эпителиальных клеток.

В непрямом методе предусматривается непрямое окрашивания антигена, который соединяется на первом этапе реакции с немеченой антисывороткой животного, заведомо содержащей хламидийные антитела, а на втором этапе проводится окрашивание образовавшегося комплекса антиген-антитело за счет добавления меченной (антивидовой) сывороткой, содержащей конъюгированные с ФИТЦ антитела к глобулинам (антигенам) сыворотки, использовавшейся на первом этапе.

Получение ложно-негативных материалов может быть связано с нарушении правил забора биологического материала (отсутствие эпителиальных клеток в мазке). Ложно-позитивные результаты являются следствием неспецифического связывания антител с неинфекционным биоматериалом.

Метод полимеразной цепной реакций (polimerase chain reaction, PCR, ПЦР) или реакция энзиматической амплификаций, предложенная Кэри Б. Мюллисом (1983), стремительно вошел в практику и работу ученых, ведущих исследования в области биологии и медицины.

ПЦР широко применяется для диагностики и типирования возбудителей хламидиозов, что связано со сложностью их культивирования.[19]

а) Быстрота анализа. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня при параллельной обработки 10-12 образцов;
б) Надежность;
в) Чувствительность;
г) Специфичность;
д) Для ПЦР пригоден любой материал, даже гистопрепараты.

а) термостабильный фермент ДНК-полимера;
б) пара олигонуклеотидных праймеров;
в) четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов;
г) копируемая ДНК;
д) ионы Mg2+ необходимые для функционирования ДНК-полимеразы;
е) буферные растворы для поддержания рН во время ПЦР между 6,8 – 7,8 и минеральное масло для предотвращение испарения.

Амплификатор – это прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающем поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.

Технология идентификации ДНК-содержащих вирусов заключается в следующем:

1) Из исследуемого материала выделяется ДНК-матрица
2) В пробирке смешивают ДНК, праймеры, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, буфер и ДНК-полимеразу
3) Пробирку со смесью нагревают до температуры денатурации ДНК (940С), при этом две цепи ДНК расходятся
4) Затем пробу инкубируют при температуре гибридизации праймеров с ДНК-матрицей (40-600С) в последующем
5) ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (720С). В результате проведенного цикла происходит удвоение искомого генетического материала
6) В последующем цикле синтез осуществляется с 4 копий, далее с 8 и т. д., до 20-30 циклов. В результате получают миллионы копий специфического участка ДНК вируса, бактерий или клеток крови.

Индикация амплифицированного генетического материала проводится выше изложенным способом. В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации.[34]

Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.

Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФЛ и 700C спирт для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов.[13]

Несмотря на растущую популярность метода ПЦР он также, как и ПИФ небезупречен, поскольку при использовании высокочувствительной и специфичной ПЦР не исключены ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Если C. psittaci обнаружена методом ПЦР, то можно ограничится только этим исследованием. Мнение, что ПЦР даже при соблюдении всех технологических требований дает ложноположительные результаты вследствие контаминации в лаборатории, не подтверждается практикой, хотя были случаи, когда ПЦР давала положительный результат, а ПИФ – отрицательный. Именно такие случаи относятся к ситуациям так называемого «субъективного характера учета результатов», полученных методом иммунофлуоресценции.

Для обнаружения в исследуемом материале хламидий можно применить иммуноэнзимный метод (ELISA). При этом используют антитела, конъюги­рован­ные с ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и др.). При наличии в исследуемом материале хламидий, то есть положительная реакция антиген-антитело, высвобождается фермент, который действует на специально вводи­мый в реагирующую смесь субстрат. Образуется цветное соединение и по интенсивности цвета, определяемого с помощью спектрофотометра, судят о ко­ли­честве и наличии антигена в забранном материале (мазке, соскобе). Иммуно­энзимный анализ, как и реакция прямой иммунофлуоресценции, может дать положите­льный результат при наличии в забранном материале нежизнеспо­собных хла­ми­дий, а также других бактерий, имеющих перекрестно реаги­рующие антигены (некоторые грамотрицательные бактерии, риккетсии Провачека и др.). Ложно-негативные результаты являются следствием низкой концентрации антигена в исследуемых образцах. Причиной ложно-позитивных результатов может быть неспецифическое связывание антител с неинфекционным биоматериалом.[18, 34]

Методы непрямого выявления хламидий.

Эта группа методов позволяет избежать ложноотрицательных результатов при прямых методах и позволяет в ряде случаев определить стадию и характер течения заболевания. Это особенно важно при персистирующей инфекции, которая поддерживает хроническое течение на протяжении многих месяцев, повреждая и разрушая ткани и органы. Методы непрямого выявления бактерий особенно хороши, если возникают трудности при взятии материала для обнаружения антител.

В основе всех этих методов лежит выявление специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови и секретах инфицированного организма, в процессе иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекционного заболевания. Антитела относятся к трем классам иммуноглобулинов: M, G и A. Накопление антител каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера инфицирования (первичное или повторное) [1, 6].

Регистрацию специфических антител можно проводить одним из иммунохимических методов. Наиболее эффективным являются методы микроиммунофлуоресцинции и рекомбинантного липополисахаридного ИФА, которые не требуют большого количества биологического материала и позволяют достаточно точно определить к какому классу относятся антитела. С помощью этих методов удается установить серологические критерии и стадии заболеваний.

Отрицательный результат серологического исследования не позволяет однозначно исключить хламидиоз, так как кроме серопозитивных встречаются и серонегативные формы этой инфекции. Выявление в крови только IgG к C. psittaci даже в высоком титре при отсутствии маркеров самого возбудителя в урогенитальном тракте не является основанием для установления диагноза. И наоборот, обнаружение IgA к C. psittaci – основание для постановки диагноза хламидиоза. Принципиального значения величина титра этих антител (IgA) и наличие или отсутствие маркеров самих хламидий в урогенитальном тракте не имеет.[18,19,39]

Методы прямого выявления хламидий.

Хламидиоз среди мелких домашних животных — достаточно распространённое заболевание, которое наиболее часто встречается у кошек. Заболевание может протекать без проявления основных клинических признаков, в скрытой форме с достаточно длительным персистированием возбудителя в организме животного, что создаёт благоприятные условия для поддержания интенсивности эпизоотического процесса.

Длительное бессимптомное течение и неспецифические симптомы заболевания затрудняют клиническую диагностику хламидиоза. Не всегда эффективны и традиционные иммунохи-мические или серологические методы анализа, т.к. хламидийная инфекция часто вызывает «неясный» иммунный ответ. Дороговизна, длительность и трудоемкость выделения возбудителя на куриных эмбрионах и в культурах клеток существенно затрудняют его использование в лабораторной диагностике, в частности в небольших ветеринарных клиниках и кабинетах.

Целью этого исследования было установить наличие циркулирующего эпизоотического процесса хламидиоза кошек.

Материалы и методы
Исследования проводили на базе ветеринарной клиники ЗАО «Айболит» г. Тюмени. В работе было использовано 117 кошек, поступивших в ветеринарную клинику с симптомами острого конъюнктивита в период с июня по октябрь 2007 года, среди всех поступивших кошек была зарегистрирована различная патология. В качестве диагностического теста использовали «Набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов», производства «ФЦТРБ-ВНИВИ» г.Казань.

Световую микроскопию производили с помощью светового микроскопа БИОЛАБ (Россия). С целью визуального обнаружения элементарных и ретикулярных телец хламидии, мазки-отпечатки с конъюнктивы глаза и тканей окрашивали по модифицированному методу Стемпа и Грамму. В качестве достоверности и подтверждения полученных результатов осуществляли постановку биологической пробы на лабораторных белых мышах.

Результаты исследований
В результате проведенных исследований по индикации хламидии в клиническом материале, полученном от 117 кошек, поступивших в клинику, в РИФ положительный результат был установлен у 36 кошек (42,1%). Параллельно с РИФ мазки-отпечатки из конъюнктивы, реагировавшие в РИФ, окрашивали по модифицированному методу Стемпа. Из 36 (42,1%) кошек, реагировавших ранее в реакции иммунофлуоресценции, при окраске по Стемпу хламидии обнаружили только у 14 (16,3%) кошек с симптомами острого конъюнктивита. Расхождения по результатам РИФ и световой микроскопии связано, скорее всего, с тем, что при световой микроскопии хламидии можно обнаружить только при их значительном количестве в клиническом материале — такое на практике бывает крайне редко.

Кроме того, положительные результаты люминесцентной микроскопии иногда могут быть обусловлены одной или несколькими причинами:
—ложноположительные результаты РИФ;
—субъективность оценки результатов РИФ;
— наличие у рептилий хламидий разных видов, которые не дают амплификацию специфичных фрагментов ДНК при использовании указанной выше тест-системы;
— погрешности при взятии и первичной обработке проб для ПНР;
— другие причины.

У остальных кошек при световой микроскопии мазков-отпечатков элементарные тельца хламидии обнаружены не были. Интересен и тот факт, что у животных, которые наблюдались в клинике с разнообразной патологией (без признаков конъюнктивита), при световой и люминесцентной микроскопии также выявлялись элементарные тельца и антиген хламидии соответственно, что может свидетельствовать об этиологической роли хламидии при различной патологии у кошек.

На основании результатов световой и люминесцентной микроскопии для подтверждения хламидийной этиологии заболеваний у кошек была проведена биопроба на белых мышах. При постановке биологической пробы в качестве первичного инфекционного материала для заражения служили смывы с конъюнктивы. Были приготовлены суспензии, которые были обработаны антибиотиками, индеферентными в отношении хламидий. Заражение белых мышей производили интраназально и в брюшную полость по общепринятой методике, всего было заражено 25 мышей. В течение 15 дней после заражения гибели лабораторных животных не наблюдали. Спустя этот срок все белые мыши были убиты. Из органов и тканей белых мышей были приготовлены мазки-отпечатки и суспензии для заражения. При световой микроскопии в мазках-отпечатках, сделанных из органов и тканей вынужденно убитых белых мышей, было обнаружено незначительное количество элементарных (окраска по модифицированному методу Стемпа) и ретикулярных телец (окраска по Грамму) хламидий.

Во втором пассаже также было использовано 25 белых мышей (интраназально и внутрибрюшинно). Гибель белых мышей во втором пассаже отмечалась на 8-10 день, при окраске мазков-отпечатков, полученных из паренхиматозных органов павших животных, были обнаружены и идентифицированы морфологические структуры хламидий.

Заключение
Таким образом, при мониторинге кошек, поступивших в ветеринарную клинику с симптомами острого конъюнктивита, вызванного хламидиозом, морфологические структуры и антиген возбудителя были обнаружены у 16,3% исследованных кошек. Все исследования подтверждены биологической пробой на белых мышах. Нашими исследованиями доказана циркуляция возбудителя хламидиоза у кошек в г.Тюмени.

Хламидиоз среди мелких домашних животных — достаточно распространённое заболевание, которое наиболее часто встречается у кошек. Заболевание может протекать без проявления основных клинических признаков, в скрытой форме с достаточно длительным персистированием возбудителя в организме животного, что создаёт благоприятные условия для поддержания интенсивности эпизоотического процесса.

Давайте будем совместно делать уникальный материал еще лучше, и после его прочтения, просим Вас сделать репост в удобную для Вас соц. сеть.